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肿瘤细胞与分子病理学
2014-10-26 20:12     (点击: )

【主要成员】

序号

姓名

性别

职称

学位

专业特长

1

 

教授

博士

肿瘤发生的分子机制及防治

2

贺修胜

教授

博士

恶性肿瘤发病易感分子机制

3

梁晓秋

教授

博士

肿瘤发生的分子机制及防治

4

谢海龙

教授

博士

肿瘤发生的分子机制

5

程爱兰

教授

博士

肿瘤发生的分子机制

6

 

副教授

博士

肿瘤防治分子机制

7

张志伟

副教授

硕士

肿瘤发病易感分子机制

8

 

副教授

博士

肿瘤发生的分子机制及防治

9

廖前进

副教授

博士

肿瘤发生的分子机制及防治

10

黄卫国

副教授

博士

肿瘤发生的分子机制

 

 

【主要研究方向、特色与优势】

一、胃癌发生与防治的分子机制

(一)胃癌发生的分子机制

1. LCM结合定量蛋白组学技术筛选胃癌组织差异表达蛋白质:通过LCM结合定量蛋白组学的方法,比较胃低分化腺癌癌性腺体及正常胃黏膜腺体细胞间蛋白质差异,共鉴定出319个蛋白质,其中表达差异在2倍以上的88个,在胃癌中呈高表达的12个、呈低表达的76个。按蛋白质功能分为七大类:细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号传导、生物代谢、凋亡,蛋白质合成与代谢类及其他蛋白质。12种高表达的蛋白质分别是细胞骨架蛋白和分泌蛋白比如VimentinCK18DecorinLumican等,低表达的76种蛋白质中,有与信号传导相关蛋白如Septin9Ras-related protein Rab-44S100P等,有与生物氧化相关蛋白如Peroxiredoxins-1Cytochrome c oxidase subunit 5B等,有与蛋白合成相关蛋白如60S ribosomal protein L8Histone H1x等,有细胞骨架蛋白如CK19Cofilin-1等,有与调亡相关蛋白如Microtubule-associated protein 1SProtein-glutamine gamma glutamyltransferase 2等,有与分子伴侣相关蛋白如HSP60HSP70HSP90β。胃癌组织中上述蛋白质的表达改变,可能参与了胃癌的发生和发展。

2. 胃癌和正常胃组织间甲基化差异:应用甲基化敏感性代表性差异分析法(MS-RDA)筛选胃癌和正常胃组织间甲基化差异DNA片段,通过MS-RDA筛选胃癌和正常胃组织间DNA甲基化差异片段, 经克隆、测序后进行生物信息学分析。结果获得3个甲基化差异片段, 分别为CRS1308 CRS1309 CRS1310序列, 其中CRS1309CRS1310已被GenBank收录, 登陆号分别为AY887106AY887107 CRS1309序列与LOC440683基因第11外显子、LOC440887基因的3'端,DRD5基因启动子和外显子区域均有很高的相似性(分别为98% 99% 94%)CRS1310序列与1999Minoru Toyota在人类结肠癌中分离出的核糖体RNA上的甲基化差异性CpG岛有很高的相似性(98%)。由以上结果得出结论:胃癌和正常胃组织间DNA甲基化存在差异, MS-RDA可有效分析这两种不同组织间甲基化的差异, 筛选出有意义的甲基化差异片段。

3. 胃癌及癌前病变组织染色体7q31.1杂合性缺失的意义:胃癌染色体7q31.1常见最小缺失区域在D7S2502~D7S480之间,在D7S486附近可能存在与胃癌相关的抑癌基因。在胃黏膜癌前病变阶段(不典型增生)可检测出染色体7q31.1区域的杂合性缺失,7q31.1 LOH可能是胃癌发生极早期的分子事件之一。

4. 湖南衡阳地区白细胞介素1BIL-1B)基因多态性与胃癌的关系以及幽门螺杆菌(Helicobacter pyloriHP)感染后胃癌发生的易感基因型:收集52例胃癌患者癌旁正常胃粘膜组织和55例慢性胃炎患者胃粘膜组织,均经快速尿素酶和PCR检测HP,应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术,进行基因型检测,并对C/CT/T进行测序,比较各基因型在胃癌组和胃炎组中的分布差异。结果显示,IL-1B-31TIL-1B-511T等位基因和IL-1B -31T/TIL-1B-511T/T基因型在胃癌组的分布频率高于胃炎组。在伴有HP感染的群体中进行比较,IL-1B-31位点各基因型未见明显差异;但IL-1B-511T等位基因和IL-1B-511T/T基因型在胃癌组的分布频率高于胃炎组。以上结果说明,在湖南衡阳地区IL-1B-31T/TIL-1B-511T/T基因型与胃癌发病风险相关,在HP被感染后IL-1B-511T/T基因型可能为湖南衡阳地区胃癌易感基因型。

5. 研究端粒重复序列结合因子1TRF1)蛋白在胃癌中的表达及其与胃癌发生发展的关系:运用Western blot方法检测TRFI蛋白在10例正常胃黏膜、15例胃癌前病变、20例胃癌、5例淋巴结转移胃癌组织中的表达。结果表明,TRFI蛋白在癌前病变组、胃癌组、转移癌组比正常组表达高;胃癌组、转移癌组比癌前病变组表达高:在胃癌组织中,TRF1蛋白的表达与胃癌分化程度有关,分化越差,表达越高。这些结果提示,TRFI蛋白可能在胃癌的发生发展中起重要作用。

6. 胃癌SGC7901细胞特异性结合肽的筛选及鉴定:利用体内噬菌体展示技术筛选与人胃癌组织特异性结合的短肽,经过四轮体内淘选,胃癌肿瘤组织噬菌体得到明显富集,测序比对后,LLRSTGF出现的次数最多,提示此短肽可能对荷瘤裸鼠模型的胃癌组织具有很强的结合力,有望成为胃癌治疗的靶点

7. 探讨胃癌细胞侵袭转移能力的改变对胃癌细胞化疗敏感性的影响:首先筛选出的人胃癌细胞MKN-28S(亚系)与MKN-28(母系)中E-CadherinMMP-2蛋白表达;transwell体外侵袭实验比较两系侵袭潜能。采用MTT法比较两系对阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、紫杉醇(PTX4种化疗药物的敏感性。结果筛选出亚系的E-Cadherin蛋白表达与母系相比显著减弱、而MMP-2蛋白表达则显著增强;细胞计数示亚系侵袭至基质胶膜背面的数量较母系明显增多;MTr示两系对5-FuADMMMC的敏感性差异有显著性,而两系对PTX的敏感性差异无显著性。这些结果说明,细胞侵袭转移能力的改变可以影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,同一遗传背景下的高侵袭转移亚系较母系耐药性更强。

 

(二)胃癌防治研究

1. 大蒜有效成分二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌细胞增殖与诱导分化及机制:DADS明显抑制MGC803细胞增殖。DADS诱导人胃癌细胞增殖抑制和分化与细胞周期G2/M期阻滞有关。DADS可能是通过靶向检查点激酶Chk1引起G2/M期阻滞。DADS阻滞人胃癌细胞于G2/M期与调节ATR/ Chk1/ Cdc25C/ cyclin B1信号通路有关,可能成为治疗胃癌的新靶点。Chk1基因沉默可明显抑制人胃癌细胞增殖,与DADS起着协同作用。DADS阻滞G2/M期是通过Chk1/CDC25C/CyclinB1信号通路起作用,其主要作用靶点是Chk1

2. DADS诱导人胃癌MGC803细胞差异表达基因克隆及G2/M周期阻滞的分子机制:成功构建了DADS诱导人胃癌MGC803细胞分化差异表达基因正、反向消减cDNA文库。通过克隆测序、Blast比对鉴定了12个已知基因,其中上调的有p21WAF1 ENO1 PFN1 PRDXFTH1MDH,下调的是PTOV1ANXA2RAC1WDR1ALDOAEWSR1,这些基因分别与细胞周期、细胞骨架、细胞迁移、细胞代谢和抗氧化等相关。

基因芯片结果显示:30mg·L-1DADS作用MGC803细胞4h后与对照组比表达上调2倍以上的基因有:CDC45LCDK5R1(p35) CDKN1A(p21) CUL4AGADD45αRAD17TP53;表达下调2倍以上的基因有:ANAPC5 ATRBRCA1CCNA2CCNB2CCNE1CCNE2CDC16CDC6CDK5RAP1GTF2H1MCM5RAD9ARGC32。该21个差异基因与DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞密切相关,其中与G2/M周期相关的基因包括:CDK5R1TP53p21GADD45αANAPC5ATRBRCA1CCNCA2CCNB2CDC6CDC16GTF2H1RGC32等。DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞,可能是多个基因和多条信号转导通路共同作用的结果。这些基因中也有G1期基因(CyclinE1CyclinE2)的改变,说明DADS对整个细胞周期都有一定的影响。 DADSMGC803细胞G2/M周期阻滞的分子机制可能与增强P53GADD45αp21表达、抑制CyclinB1表达有关。

3. 人胃癌细胞中肿瘤干细胞(CSCs)样细胞筛选及DADSDATS诱导的生长抑制作用:磁珠分选术(MACS)从胃癌SGC-7901细胞中筛选出人胃癌CD44(+)CSCs细胞,采用免疫荧光流式细胞术、球状体形成、软琼脂集落形成等实验鉴定胃癌CSCs细胞。结果从人胃癌细胞SGC-7901中筛选出CD44阳性CSCs细胞,并且发现,大蒜有效成分DADSDATS均可抑制CD44(+)胃癌CSCs细胞增殖及阻滞细胞于G2/MDADS可抑制SGC7901细胞及胃癌CSCs细胞中Aurora-AAurora-B表达,Aurora-AAurora-B表达下调可能参与DADS抗胃癌作用。c-FLIP蛋白的表达下调可能是DATS抑制人胃癌细胞及其CSCs细胞增殖作用的分子机制之一。

4. DADS下调uPAR抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭:miR-uPAR干扰载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR)转染细胞后可明显抑制人胃癌MGC803细胞中uPAR表达。microRNA抑制uPAR表达后,可抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移、侵袭,并且增强DADS的增殖抑制及迁移、侵袭阻滞作用,说明uPAR表达下调可能是DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制之一。

5. RNA干扰EMS1基因表达对胃癌MGC803细胞株增殖和迁移的影响:干扰EMS1基因表达后,胃癌MGC803细胞增殖能力明显降低;干扰EMS1基因表达后,胃癌MGC803细胞迁移侵袭能力明显减弱;干扰EMS1基因表达后,胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤的增殖能力降低。

6. siRNA干扰Survivin对人胃癌SGC-7901细胞的影响:Survivin siRNA转染细胞后可明显抑制人胃癌SGC-7901细胞中Survivin基因的表达。Survivin siRNA抑制Survivin基因表达后,可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,促进细胞凋亡,对G0/G1期有阻滞作用。

7. DATS抑制人胃癌细胞增殖与诱导凋亡及机制: DATS可抑制人胃癌MGC803细胞生长并诱导凋亡。人细胞凋亡基因芯片检测结果表明, DATS作用后出现16个凋亡相关基因表达差异,RT-PCR证实,SODD基因mRNA表达上调、Apaf-1基因mRNA表达下调。因此得出结论,DATS诱导人胃癌MGC803细胞凋亡可能与多个基因和信号转导通路作用有关。

 

二、鼻咽癌及喉癌易感分子机制研究

1.鼻咽癌易感分子机制研究:STGC3基因是一个新近克隆的肿瘤相关基因,前期的体外实验研究结果表明,STGC3基因在CNE2鼻咽癌细胞系高表达,可明显抑制CNE2的生长增殖。我们采用Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系接种于裸鼠皮下,以强力霉素(Dox)诱导STGC3基因高表达,观测STGC3基因高表达对CNE2裸鼠体内成瘤的影响,并探讨其可能作用机制;运用RT-PCR、蛋白质印迹及免疫组织化学方法,分别从mRNA和蛋白质水平,分析瘤组织中STGC3基因的表达;用流式细胞仪检测移植瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况;用免疫组织化学方法,检测移植瘤组织凋亡相关蛋白Bcl-2Bax的表达。研究结果显示,STGC3蛋白表达主要定位于细胞核内,Dox诱导STGC3基因在Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系高表达,Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系裸鼠体内成瘤受到明显抑制,与对照组比较,移植瘤成瘤时间晚、生长慢、肿块小、细胞凋亡率高,Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减少。此体内实验研究结果与前期体外实验结果一致,进一步证明STGC3基因对肿瘤细胞生长具有抑制作用。miRNA30-based shRNA可下调STGC3基因在人鼻咽上皮细胞系NP69细胞系中的表达。STGC3表达下调,使NP69细胞系生长增殖速度加快,其机制可能与影响细胞周期和减少细胞凋亡有关。采用基因定点突变技术,将鼻咽癌候选抑瘤基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)缺失掉,通过观察LG缺失的STGC3基因对人鼻咽癌细胞系CNE2生长增殖的影响,探讨STGC3蛋白质在细胞生长增殖中发挥负性调控作用的结构域。结果显示,STGC3基因LG domain的缺失突变,导致该基因的细胞生长增殖负调控作用降低。LG domainSTGC3蛋白质的重要功能结构域。

pcDNA31-NPCEDRG重组质粒为模板,PCR技术扩增NPCEDRG基因编码区,亚克隆到pRevTRE载体,PCR及双酶切鉴定,测序验证。结果发现,以pRevTRE—NPCEDRG重组载体为模板PCR扩增以及双酶切重组载体,分别产生530bp520bp长度的片断,测序结果证实插入片段方向正确,序列与Genebank已知序列一致,NPCEDRG基因编码区成功插入pRevTRE载体。实验成功构建了受Tet系统调控NPCEDRG基因表达的pRevTRE-NPCEDRG真核诱导表达载体,为深入研究NPCEDRG基因功能和揭示鼻咽癌发病分子机制提供实验手段。

2.喉癌易感分子机制研究:Laryngeal carcinoma related gene 1LCRG1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,我们应用5′RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169-127区域的启动子活性最高。研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169-127范围内。通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因(-169~+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169-57。应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137-122。生物信息学提示该区存在SP1E2F1/DP1EKLFZF9转录因子结合位点。利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Spl为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达。凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Spl结合位点。LCRG1基因启动子-137-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据。

 

三、白血病防治的分子机制

二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60细胞分化、凋亡与G2/M期阻滞作用:DADS可诱导HL-60细胞分化、凋亡与G2/M期阻滞。我们构建了具有高消减效率的DADS诱导白血病分化的cDNA文库,通过挑取文库中的30个克隆制备质粒并酶切分析、测序和同源性检索,结果18个克隆均具有100600bp左右的插入片段,测序分析发现10个差异表达基因,分别与细胞周期、信号转导、代谢、RNA结合等有关;RT-PCR验证其中上调的3个基因:p21STAT1CAMTA1,结果与SSH相符,说明:p21STAT1CAMTA1表达上调与DADS诱导白血病分化密切相关。蛋白质组学研究结果表明,对照组和处理组蛋白质表达相差2倍以上的点有29个,其中22个上调,7个下调;质谱分析和数据库搜索鉴定了9个蛋白质点,其中7个蛋白质点有意义,这些蛋白功能分别与信号转导、基因转录及调控、细胞骨架、细胞新陈代谢等有关。Western blotRT-PCR结果显示DADS处理后Rac2ras-related C3 botulinum toxin substrate2)表达明显上调,提示Rac2等蛋白参与了DADS诱导的HL-60细胞凋亡。DADS能诱导HL-60细胞增殖抑制和G2/M阻滞,其抑制增殖作用与PCNA表达下调有关。Mcl-1基因沉默可增强DADSHL-60细胞G2/M期阻滞作用。

 

近年主要建设成就

在学校下拨经费的资助下,在学校主管职能部门、医学院及肿瘤研究所大力支持下,本团队根据申报书目标,积极进行各项研究工作与人才队伍建设,通过团队建设,团队共承担国家级项目8项,省部厅级项目4项。晋升副高级职称1人,培养博士4人,获得公派出国留学资格2人。参与国际国内学术会议10人次。建设成效主要体现在以下4个方面:

1、承担了一批国家和湖南省科技创新项目。团队积极申报各项科研课题,科研项目立项数量、立项层次和项目资助经费逐年升高,两年来,创新团队累计承担各类科技项目12项,其中国家级项目8项,省部厅级项目4项,共争取项目研究经费200多万元 

2、人才培养建设情况:学科现有一支结构合理、学术水平较高、发展潜力大的学科队伍,包括:教授9人(新增教授1人), 副教授9人(新增副教授1人);出国留学归国人员1名,另有2人被国家留学基金委批准正在准备出国留学,有2名是湖南省121人才工程入选人才,新增博士后研究人员1人,培养在读研究生40人,使本研究团队成为我国肿瘤研究基础和应用基础研究领域人才培养的重要基地。

3、取得了一批原创性科技成果。两年来,团队取得了一批有影响的科技成果。在国内、外核心期刊发表科技论文30多篇,被SCI系统收录19篇,有一篇影响因子达到5.016;湖南省优秀硕士论文2

通过两年的建设,本创新团队基本达到了预期研究和建设目标。

 

    【建设目标】

    1.总体目标

经过35年的建设,拟申请的校级高校科技创新团队将具有三个方面的职能:人才培养(即高层次学术带头人培养,以及配合南华大学的本科和研究生教育)、科学研究(恶性肿瘤发生的机制、早期诊断与防治的相关基础与应用基础研究)、培训与研发(以申请的创新团队所在研究所及南华大学生命科学中心实验室为平台,在全国特别是全省范围内对本研究领域的研究人员进行技术培训,提供技术支持;与企业单位联合进行技术开发和肿瘤早期诊断标记物与肿瘤靶向治疗药物研发,推进科技成果的转化)。

以肿瘤发生与防治的分子机制研究为重点,开展具有国际先进水平的原创性研究和关键技术攻关在胃癌、鼻咽癌等领域取得一批标志性成果。同时建设一个国内一流、国际先进的肿瘤细胞与分子病理学研究开放性基地与平台,提高我省在这些领域的科技攻关能力和对胃癌、鼻咽癌等常见肿瘤的防治能力。以学科带头人和学术骨干培养为重点,组建一支创新团队,培养一批在国内外有重要影响的科技领军人物,培养和造就一批高素质高层次的研究人才队伍。力争实现以下目标:

1、充分发挥科研队伍积极性,进一步整合力量,加大高水平、高层次人才培养力度。

2、培养和吸引高层人才,多方位筹集经费,加大科研投入,充分利用有限资源,改善科研条件。

3、进一步凝练科学研究方向,集中研究力量,争取在申请国家级重大、重点项目方面有所突破,在申报国家级科研成果方面取得突破。

4、加强国际国内间的合作,积极开展国际国内合作与学术交流,吸收其他实验室先进的管理经验和技术。

5、争取申报湖南省高校科技创新团队。

    2.人才队伍建设目标

通过科学研究达到高层次人才培养的目的是拟申请高校科技创新团队的主要目标之一。人才培养将分为本团队高层次研究人员的培养和高水平的研究生培养。至组建期满时,本团队研究人员能有1人成为在省内有重要影响的学科带头人,12人成为湖南省青年骨干教师,在每个主要研究方向上均造就12名优秀的中青年学术带头人。从国内外引进1名高层次研究人员进入创新团队。并将通过各种形式派本团队研究人员到国外学习深造,至建设期满时,研究人员中有国外留学经历者达20%。至建设期满时,博士后研究人员达到4人,在读研究生人数达到50人,使本研究团队成为我国肿瘤研究基础和应用基础研究领域人才培养的重要基地。

    3.科技成果目标

将多方位筹集经费,加大科研投入,充分利用有限资源,改善科研环境,提升研究水平,力争实现以下目标:

1、争取获得国家级科研项目3-6项,省部级研究项目5-10项,获省部级科技进步奖以上奖励1-2项,出版专著、教材1-2部,在国内外核心刊物和国际会议上发表论文50-100篇,其中SCI检索论文10-20篇。

2、参加国内外学术会议40-60人次,举办国内外学术会议1-2次。

本创新团队旨在结合湖南省中长期科技发展战略,瞄准国内外胃癌、鼻咽癌等恶性肿瘤发生及防治分子机制,探讨其发生与防治的关键问题,力图取得系列标志性原创成果;建成国内领先、国际先进的“肿瘤细胞与分子病理学” 科技创新团队,增强我省在肿瘤防治领域中的科技攻关能力,提升肿瘤发病与防治研究的水平,为促进我省医疗卫生事业发展和提高人民群众健康水平做出应有贡献。

 

社会评价

1、团队研究工作取得的标志性成果和发展前景(包括对团队研究现状,今后拟开展研究工作及发展前景的具体评议意见)

“肿瘤细胞与分子病理学”高校创新团队从胃癌发生的分子机制及防治研究、鼻咽癌及喉癌易感分子机制研究、白血病与淋巴瘤发生的分子机制研究三个方向开展了系统性研究,在团队和带头人集体指导下,取得了一批原创性科技成果承担了一批国家和湖南省科技创新项目两年来,团队共获国家自然科学基金8项、省厅级项目4项,累计经费200多万元;发表科研论文30多篇,其中SCI收录19篇。同时通过团队建设与省高校重点实验室、省级重点学科建设,极大地改善了研发平台和创新环境。

2、团队建设发展情况(包括对团队凝聚力、成员间合作情况、设备和资源共享情况、带头人协调能力,团队创新潜力等的具体评议意见)

本团队机制健全,成员间协作精神好,主要体现在:1、形成了稳定的研究方向:创新团队自建设以来,形成了三个稳定的研究方向:1)胃癌发生的分子机制及防治研究; 2)鼻咽癌及喉癌易感分子机制研究;3)白血病与淋巴瘤发生的分子机制研究。2、建立了结构合理、学术水平较高的科学研究梯队:创新团队自建设以来,建立了一支结构合理、学术水平较高、发展潜力大的科学研究学科梯队,新增教授和副教授各1人,因此现有教授增至5人,副教授增至5人;具有海外留学经历新增1人,新批准公派出国留学2人,新增博士后1人。团队绝大多数成员45岁以下,且全部成员均拥有博士学位,多人有国外研究经历,具有良好的创新思维能力。这些年轻科技人才为团队今后的快速发展提供了人才保障,他们完全有能力出高水平成果、并成为本学科在国内外有影响的创新人才。

3、团队存在的不足和建议,其它意见或建议。

成果转化力度有待加强;国际国内合作力度有待加强;高层次领军人才的培养与引进力度有待加强:如长江学者芙蓉学者湖南省百人计划等,加强海外高层次人才引进力度。

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